一(yi)、 高保真DNA聚合酶

DNA聚合(he)酶(mei)（DNA polymerase）是(shi)細胞(bao)復(fu)(fu)制(zhi)DNA的(de)(de)(de)重要(yao)作用(yong)酶(mei)。DNA聚合(he)酶(mei) ,以(yi)DNA為復(fu)(fu)制(zhi)模板，從將(jiang)DNA由5'端點開始復(fu)(fu)制(zhi)到3'端的(de)(de)(de)酶(mei)。DNA聚合(he)酶(mei)的(de)(de)(de)主(zhu)要(yao)活(huo)性(xing)是(shi)催化DNA的(de)(de)(de)合(he)成（在具備模板、引物、dNTP等(deng)的(de)(de)(de)情(qing)況下）及其(qi)相輔(fu)的(de)(de)(de)活(huo)性(xing)。

高保(bao)真DNA聚合(he)酶(mei)保(bao)真性的一(yi)個通用(yong)標準是錯(cuo)(cuo)配率，錯(cuo)(cuo)配率越(yue)低(di)保(bao)真性越(yue)好。

普通DNA聚合(he)酶的錯配率在10-5堿基(ji)/循環數，而(er)高(gao)保(bao)真DNA聚合(he)酶錯配率可(ke)降(jiang)到10-6數量級，大(da)大(da)降(jiang)低了出(chu)錯的可(ke)能性(xing)；它適合(he)對PCR保(bao)真性(xing)要求(qiu)較高(gao)的實驗(yan)，如基(ji)因篩選、測(ce)序、突變檢測(ce)等(deng)

高(gao)保(bao)真(zhen)DNA聚合酶的保(bao)真(zhen)原(yuan)理(li)是：高(gao)保(bao)真(zhen)DNA聚合酶具有3'到5'核酸外切酶的活性，PCR擴增途(tu)中如(ru)果產生(sheng)了錯配的堿基，它可以將其切掉，從而保(bao)證了擴增的準確性.

高(gao)保真DNA聚合酶(mei)(mei)的外(wai)切活(huo)性(xing)會(hui)導致(zhi)PCR反應(ying)之后(hou)不(bu)會(hui)加(jia)尾(wei)，所(suo)以(yi)如果要(yao)進行(xing)TA克隆，要(yao)先進行(xing)PCR產物回收(shou)（否則影響(xiang)加(jia)尾(wei)），然后(hou)回收(shou)產物用(yong)普通Taq酶(mei)(mei)72度保溫一段時(shi)間，從而(er)利用(yong)普通Taq酶(mei)(mei)加(jia)尾(wei)的活(huo)性(xing)。

二、 第二(er)代基(ji)因工程酶

一代DNA聚合酶(mei)(mei)(mei)：純化(hua)發酵產物得到(dao)的DNA聚合酶(mei)(mei)(mei)，或對(dui)酶(mei)(mei)(mei)蛋白(bai)進(jin)行抗(kang)體或化(hua)學修(xiu)飾以達到(dao)熱啟動(dong)。目前市面(mian)的DNA聚合酶(mei)(mei)(mei)，絕大部分是一代酶(mei)(mei)(mei)，如金牌(pai)酶(mei)(mei)(mei)、Phusion高保真酶(mei)(mei)(mei)等(deng)。

第二(er)代基因工程DNA聚合酶(mei)：通(tong)過對(dui)酶(mei)的(de)基因序列進行(xing)改造，進而(er)改變酶(mei)蛋(dan)白(bai)的(de)氨基酸序列，通(tong)過分子進化平臺對(dui)酶(mei)性能進行(xing)篩選，選擇(ze)符合特定(ding)實驗要求的(de)酶(mei)。如KAPA2G Fast,2G Robust，HiFi Fiedlity ，Long Range酶(mei)，G5 High-Fidelity DNA Polymerase等。

三、 G5 High-Fidelity DNA Polymerase聚合酶

G5 High-Fidelity DNA Polymerase聚(ju)合酶(mei)(mei)(mei)(mei)是一種新型的單(dan)酶(mei)(mei)(mei)(mei)體系，同(tong)其他的高(gao)(gao)保(bao)真(zhen)酶(mei)(mei)(mei)(mei)和聚(ju)合酶(mei)(mei)(mei)(mei)品牌相(xiang)比具有行(xing)業領(ling)導性能。G5 High-Fidelity DNA Polymerase高(gao)(gao)保(bao)真(zhen)酶(mei)(mei)(mei)(mei)進行(xing)了(le)基(ji)因改造，增加了(le)對DNA的親(qin)和力，不需(xu)要結(jie)合額外的蛋白域。G5 High-Fidelity DNA Polymerase聚(ju)合酶(mei)(mei)(mei)(mei)具有的高(gao)(gao)合成能力導致產量、靈敏(min)度、效率、目(mu)的片段(duan)長(chang)度和擴增困難模板（例如高(gao)(gao)GC含量）能力的顯著提高(gao)(gao)，使(shi)用(yong)一個單(dan)一酶(mei)(mei)(mei)(mei)實(shi)現高(gao)(gao)保(bao)真(zhen)PCR的標準化。

熱啟(qi)動(dong)配方中，酶是結合在(zai)一(yi)(yi)個特(te)定的載(zai)體(ti)上，使其在(zai)第(di)一(yi)(yi)步變性之前一(yi)(yi)直保持滅活(huo)的狀態(tai)。這樣(yang)就消除了反應(ying)設定和(he)啟(qi)動(dong)過程(cheng)中非特(te)異性啟(qi)動(dong)導致的產物擴增，進而增加(jia)了整體(ti)反應(ying)的效率(lv)和(he)靈(ling)敏度。

G5 High-Fidelity DNA Polymerase高保真DNA聚合(he)酶(mei)是二代基因工(gong)程(cheng)酶(mei)，具有以下(xia)特點：

1. 超(chao)高保真(zhen)，通過大(da)規模二代測(ce)序得出的(de)出錯率：2.8×10^-7；

2. 可以(yi)擴增(zeng)各種(zhong)復雜(za)模(mo)版；

3. 擴(kuo)增片段長，擴(kuo)增基(ji)因組可達(da)(da)15kb,質粒DNA或噬菌(jun)體DNA可達(da)(da)18kb；

4. 擴(kuo)增速(su)度快，可節省75%以上(shang)的(de)時間；

四(si)、 G5 High-Fidelity DNA Polymerase高(gao)保真(zhen)DNA聚合(he)酶合(he)成(cheng)能力(li)

合成(cheng)能力被定義(yi)為聚合酶每個結(jie)合單位合成(cheng)的(de)(de)(de)(de)核苷酸數量，同時也是延(yan)伸(shen)速(su)度和穩健性的(de)(de)(de)(de)主要(yao)決(jue)定因素。相比于(yu)融合技術將DNA結(jie)合蛋白鏈接到Pfu-like聚合酶來提(ti)高(gao)合成(cheng)能力，G5 High-Fidelity DNA Polymerase高(gao)保真DNA聚合酶經過(guo)基(ji)因工程改造，增(zeng)加了DNA的(de)(de)(de)(de)親和力，而不需要(yao)輔助(zhu)蛋白質域。這種內在的(de)(de)(de)(de)高(gao)合成(cheng)能力導致產量、靈敏度、速(su)度、模(mo)板(ban)長度以及對(dui)困難(nan)模(mo)板(ban)擴增(zeng)能力的(de)(de)(de)(de)顯著(zhu)提(ti)升，

當執(zhi)行高保(bao)真PCR時，在產(chan)生足夠的(de)(de)(de)產(chan)物用(yong)于克隆的(de)(de)(de)前提下減(jian)少循環數(shu)(shu)是很重(zhong)要的(de)(de)(de)。額(e)外的(de)(de)(de)循環數(shu)(shu)增加(jia)了產(chan)量卻降低了保(bao)真性：反(fan)應(ying)早期少量的(de)(de)(de)錯配都是固定的(de)(de)(de)，此后(hou)(hou)在每一個(ge)連(lian)續循環中都得到放大。在隨后(hou)(hou)的(de)(de)(de)周期，任(ren)何額(e)外的(de)(de)(de)錯誤(wu)都將(jiang)導致(zhi)突變擴增的(de)(de)(de)比例增加(jia)。

**合(he)(he)成能力定義為一分子的DNA聚(ju)合(he)(he)酶(mei)在催化反(fan)應(ying)中延伸的核苷酸數量。

五(wu)、 G5 High-Fidelity DNA Polymerase聚合(he)酶的(de)表現(xian)

1. 保真性

G5 High-Fidelity DNA Polymerase高保真酶擴增(zeng)的(de)(de)出錯率(lv)是野生(sheng)型(xing)Taq酶的(de)(de)1/100，是Taqblends的(de)(de)1/40，是野生(sheng)型(xing)Pfu的(de)(de)1/3，是Phusion的(de)(de)1/2。

2. 擴增產(chan)量高、靈敏性(xing)高

G5 High-Fidelity DNA Polymerase用(yong)于擴增的(de)(de)hgDNA目(mu)的(de)(de)片(pian)段(duan)最多達到(dao)11 Kb。每個目(mu)的(de)(de)片(pian)段(duan)長(chang)度的(de)(de)產物擴增的(de)(de)hgDNA模版(ban)濃度范圍(wei)為（50毫(hao)微克至0.5納克每反應(ying)） 。25μL反(fan)(fan)應體系， 采用標準(zhun)的(de)3步法的(de)循環擴增（ 35個循環） ： 15秒20秒變性(xing)，退(tui)火(huo)， 30秒/kb延(yan)長(chang)時(shi)間。總的(de)反(fan)(fan)應時(shi)間為11 kb的(de)擴增子是3小時(shi)50分(fen)鐘。 每個反(fan)(fan)應加(jia)12.5微(wei)升進行(xing)電泳

3. 擴(kuo)增復雜模版

G5 High-Fidelity DNA Polymerase聚合酶在擴增(zeng)困(kun)難(nan)模版(ban)上具有強大的性(xing)能

4. 高敏感(gan)性(xing)和保真性(xing)

單(dan)酶(mei)校正聚合(he)酶(mei)的(de)一個主要的(de)限制就在于(yu)損(sun)壞的(de)核苷酸(suan)和引(yin)物降解導(dao)致的(de)低靈(ling)(ling)敏(min)度。經過(guo)基(ji)因工程改(gai)造的(de)新(xin)貝生物G5 High-Fidelity DNA Polymerase聚合(he)酶(mei)在靈(ling)(ling)敏(min)度方面(mian)有(you)巨(ju)大的(de)提(ti)高(gao)，勝過(guo)Fusion技術聚合酶和其他品(pin)牌的聚合酶。

六、   G5 High-Fidelity DNA Polymerase高保真DNA聚(ju)合酶的應用：

1. 基因定(ding)點突變；

2. 測序；

3. 蛋(dan)白表達

七、 疑難問題(ti)與解答