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2× S6 miRNA SYBR qPCR Mix ;
貨 號：Q206
保存條件：- 20 ℃避光長期儲存(cun)；4℃避光存(cun)放6個月。
產品介紹：
本(ben)品(pin)為SYBR Green I 嵌合熒(ying)光(guang)法進行miRNA定量(liang)反(fan)應(ying)的(de)(de)專用(yong)qPCR預混。該(gai)預混液(ye)包含(han)qPCR所需(xu)的(de)(de)酶、dNTP、緩沖液(ye)、熒(ying)光(guang)染料、參(can)比(bi)染料等(deng)(deng)組分，使用(yong)時只需(xu)加(jia)入模板、引物、水即可，簡便易用(yong)。其中本(ben)品(pin)所使用(yong)的(de)(de)聚合酶采用(yong)了國(guo)際領先的(de)(de)啟(qi)(qi)動(dong)技術，較(jiao)之抗體封閉(bi)、化(hua)學修飾等(deng)(deng)熱(re)啟(qi)(qi)動(dong)方式(shi)具(ju)有封閉(bi)效率(lv)高(gao)，酶活釋放快(kuai)的(de)(de)優勢。搭配針對(dui)qPCR精心優化(hua)的(de)(de)緩沖體系，該(gai)預混液(ye)具(ju)有靈敏(min)度高(gao)，特(te)異(yi)性強、定量(liang)范圍(wei)廣、重復性好的(de)(de)特(te)點。另外(wai)本(ben)品(pin)預混了特(te)殊的(de)(de)ROX參(can)比(bi)染料，可兼容所有qPCR儀器(qi)，無需(xu)針對(dui)不(bu)同儀器(qi)額外(wai)添加(jia)相應(ying)的(de)(de)ROX。推(tui)薦(jian)與本(ben)公司HyperScriptTM III miRNA 1st StrandcDNA Synthesis Kit(by stem-loop)(NovaBio # R601)配合使用(yong)。
產品(pin)組成：
溫馨提(ti)示：
·本品已預(yu)混適用(yong)所(suo)有qPCR儀(yi)器的ROX參比染料(liao)，無需額外(wai)添加(jia)ROX；
·若解凍(dong)后管底出現白(bai)色或淡紅色沉淀，請(qing)顛倒混勻(yun)確保(bao)沉淀完(wan)全溶(rong)解后使用；
·本品含有熒(ying)光(guang)染料SYBR Green I，使用和存儲(chu)時請避免(mian)強光(guang)照(zhao)射；
·配置反應液(ye)時，請(qing)使用滅菌槍頭、Microtube等，同時避免產生氣泡；
產品使用(yong)：
A.推薦反應體系(xi)
2×S6 miRNA SYBR qPCR Mix 在(zai)冰(bing)上解凍(dong)后(hou)，混勻,按如(ru)下順(shun)序加(jia)樣：
注：引(yin)(yin)物和模板使用量請根(gen)據需要調(diao)整，引(yin)(yin)物的(de)終濃度范圍在(zai)0.1-1 μM，通常引(yin)(yin)物的(de)使用量增加可以提高靈敏度（Ct減(jian)小(xiao)）但同時會降低(di)特異性（出現(xian)引(yin)(yin)物二聚(ju)體等非特異性產物）；未稀釋的(de)cDNA的(de)加入量不應超過總反應體積的(de)1/10。
B.推薦反應程(cheng)序
注：預變性溫(wen)度(du)(du)(du)和時(shi)間可(ke)(ke)以根據模(mo)板復雜度(du)(du)(du)進行(xing)調整，如模(mo)板復雜度(du)(du)(du)較高可(ke)(ke)以提高預變性溫(wen)度(du)(du)(du)并延(yan)長時(shi)間；對(dui)于(yu)長度(du)(du)(du)小于(yu)200bp的(de)擴增子，可(ke)(ke)以使用(yong)快速程(cheng)序，即變性時(shi)間3秒，退(tui)火(huo)(huo)和延(yan)伸(shen)時(shi)間10秒。對(dui)于(yu)高GC的(de)擴增子，可(ke)(ke)提高退(tui)火(huo)(huo)延(yan)伸(shen)溫(wen)度(du)(du)(du)至65℃；循環數設(she)置為(wei)40-45可(ke)(ke)滿足絕大多數的(de)反(fan)應；對(dui)于(yu)Tm較低的(de)引物，可(ke)(ke)使用(yong)三(san)步法，比如退(tui)火(huo)(huo)溫(wen)度(du)(du)(du)設(she)置在55℃，延(yan)伸(shen)溫(wen)度(du)(du)(du)設(she)置為(wei)72℃，信(xin)號采集設(she)置在延(yan)伸(shen)步驟。
常(chang)見問題及解決方(fang)案：
問題 | 可能原因 | 解(jie)決方案(an) |
無擴增曲線 | 缺(que)少qPCR反應(ying)必(bi)需組分 | 確(que)認是否加(jia)入(ru)適當(dang)的模板和引物 |
反應程序(xu)設置不正確 | 確認選擇(ze)FAM/SYBR的檢測通道；確認信號采(cai)集設(she)置(zhi)(zhi)正確，兩步(bu)法(fa)設(she)置(zhi)(zhi)在退火延(yan)伸步(bu)驟，三(san)步(bu)法(fa)設(she)置(zhi)(zhi)在延(yan)伸步(bu)驟 |
試劑存(cun)在污染或過期 | 更換新的試劑 |
模板或引物存在降解 | 更換新的模板或引物 |
模板投入量過低 | 適當提(ti)高模板投入量(liang) |
加(jia)樣時帶入了(le)PCR抑制物質 | 通常抑制劑是模板純(chun)化(hua)時(shi)殘留的物質，該情況(kuang)可(ke)通過稀釋模板緩(huan)解；必要時(shi)可(ke)進一步純(chun)化(hua)模板 |
復(fu)孔重(zhong)復(fu)性差 | 模板濃度較低，加樣不精(jing)確 | 請避(bi)免(mian)加(jia)入小體積的低濃度模(mo)板(ban)，該情況下可(ke)以進(jin)一步稀釋模(mo)板(ban)后加(jia)入大體積 |
管材封閉性存在問題 | 上機前請確認PCR管已(yi)被封閉好(hao)，必(bi)要時更換(huan)管材 |
組分沒有充分混勻 | 請確保(bao)mix被充分混勻 |
PCR管(guan)中存(cun)在氣(qi)泡 | 請(qing)避免出現(xian)氣(qi)泡 |
融解曲線不是單峰 | 出(chu)現Tm值(zhi)低于目的(de)產物Tm值(zhi)的(de)融解峰，低Tm值(zhi)的(de)峰一(yi)般為引物二聚(ju)體 | 通過(guo)NTC（不加模板的control）確(que)認(ren)，NTC如(ru)出(chu)現同樣Tm值較低的融解(jie)峰則可(ke)確(que)認(ren)為由引(yin)物二聚體引(yin)起(qi)。可(ke)通過(guo)提高(gao)退火溫度，重新(xin)設計引(yin)物解(jie)決(jue)（避免上(shang)下游引(yin)物3’端互補(bu)配對） |
出(chu)現Tm值(zhi)高于目的產物的Tm值(zhi)的融解(jie)峰，一般認為是過度擴增(zeng)造成(cheng) | 可通過降低模板(ban)投(tou)入量，減少退火延(yan)伸時間(jian)解決 |
使用cDNA存在基因組污染或mRNA存在可變(bian)剪切(qie) | 使(shi)用(yong)DNaseⅠ處理模板或跨內(nei)含子設計引物；更換可以區分(fen)可變剪接的引物。 |
極少數目的(de)產物(wu)過長(chang)會分段解(jie)鏈形成雙峰 | 除非必(bi)要，請盡量將擴(kuo)增子的長(chang)度(du)控制在(zai)70-200bp的范圍 |
標(biao)準曲(qu)線線性關系(xi)不佳 | 出現(xian)明顯異常(chang)的點（加樣(yang)或(huo)儀器不(bu)穩(wen)定造成） | 剔除異(yi)常點進行計算 |
標準品降(jiang)解 | 更換新的標準品 |
反(fan)應液中引(yin)入(ru)了(le)抑(yi)制物 | 找到抑制物來源，更換相應組分 |
NTC存在污染(ran) | 更(geng)換試劑及實驗(yan)環(huan)境（可(ke)在紫外滅菌(jun)后(hou)的超凈臺操作） |
低(di)模(mo)板量加樣存在誤差 | 進(jin)一(yi)步稀釋低濃度模板后(hou)加入大體積 |
與其他qPCR試劑相比，Tm值(zhi)不同 | 不同廠家(jia)的buffer使用(yong)了不同的鹽(yan)離子濃度 | 內參基因(yin)和目的基因(yin)使用同(tong)一品牌試劑即可進(jin)行(xing)相對(dui)定量，Tm絕對(dui)值(zhi)沒有比較參考價值(zhi)的。 |
是(shi)否(fou)需要冰上(shang)操作 |
| 本品(pin)含有(you)的(de)熱啟動Taq DNA Polymerase可(ke)避免室溫下引物的(de)非(fei)特異性延伸，可(ke)以(yi)常溫配置體系 |
是否兼(jian)容快速程序 |
| 擴(kuo)增子在(zai)70-200bp時可(ke)使(shi)(shi)用快速(su)程序，根據(ju)不同儀器可(ke)以節省40%-60%的時間，擴(kuo)增子>200bp時，請使(shi)(shi)用標準程序。 |
本品僅供(gong)科研使用(yong)，不能用(yong)于人和動物醫療診斷(duan)
