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One-Tube Cloning Kit                                                 

貨　    號：B101

保存條件：- 20 ℃

產(chan)品介紹：

本品含有的(de)5 × One-Tube Cloning Mix可將(jiang)單個(ge)(ge)或者多(duo)(duo)個(ge)(ge)片段(duan)(duan)(duan)基(ji)于同源重組原(yuan)理克隆至目標(biao)載體，克服了傳(chuan)統(tong)酶(mei)切(qie)連(lian)(lian)接需要(yao)特定(ding)酶(mei)切(qie)位(wei)點的(de)缺(que)(que)點，具有DNA使用量少(shao)、兼容(rong)長(chang)短片段(duan)(duan)(duan)、方便簡單的(de)特點。重組后的(de)產物(wu)可以直接用于轉(zhuan)化。反應只需要(yao)在恒溫儀器里面(mian)進行（50℃重組反應5-15min)，相(xiang)比傳(chuan)統(tong)酶(mei)切(qie)連(lian)(lian)接耗時(shi)長(chang)缺(que)(que)點，本品有明(ming)顯的(de)優(you)勢。單片段(duan)(duan)(duan)及多(duo)(duo)片段(duan)(duan)(duan)重組過程如(ru)下：

產(chan)品(pin)組成：

產品特點：

任意(yi)·無需找酶切位點，不(bu)引入(ru)額外序列；

簡單(dan)·預混液,一管(guan)Mix解決克隆問題；

快速·重組(zu)只需要5-15分鐘；

產品(pin)使用：

A.制備線性化目標載(zai)體

目標載(zai)體可以(yi)通過(guo)酶切(qie)(qie)方(fang)式線(xian)性化（推薦(jian)(jian)使(shi)用(yong)雙(shuang)酶切(qie)(qie)，酶切(qie)(qie)徹底(di)以(yi)減少假(jia)陽性克隆(long)）；或者通過(guo)PCR方(fang)式線(xian)性化（即把需要的骨架(jia)部(bu)分PCR出(chu)來，注意環狀(zhuang)質粒作為PCR模板加入0.1 -1.0 ng，以(yi)減少假(jia)陽性克隆(long)）。PCR擴增推薦(jian)(jian)使(shi)用(yong)NovaBio # T202 或者NovaBio # G302）。推薦(jian)(jian)使(shi)用(yong)膠回收(shou)線(xian)性化的目標載(zai)體。如下以(yi)EcoRI 、BamHI雙(shuang)酶切(qie)(qie)pUC19為例(li)：

B.獲得目標片段

目標片(pian)段擴(kuo)增(zeng)引(yin)物5’端分(fen)別引(yin)入與線性(xing)化載體(ti)兩端一致的15-25 bp同源臂序列（酶切位點(dian)不(bu)計入同源臂長度）。

PCR擴增推薦(jian)使用(yong)NovaBio# T202 或者NovaBio # G302，PCR產物純化后用(yong)于下一(yi)步實(shi)驗(yan)。

B.1 獲得單片段目標片段引(yin)物(wu)設計（以(yi)GAPDH克隆到pUC19載(zai)體為例(li)）

GAPDH用含同源臂的(de)(de)引物(wu)擴增（紅色的(de)(de)酶切(qie)位(wei)點(dian)序(xu)列可以去除，按實(shi)際需要處(chu)理）：

B.2 獲得多片段(duan)目標片段(duan)引物設計(ji)（以GAPDH與GFP融(rong)合克隆到pUC19載體為例）

B.2.1   GAPDH用含同源臂的引物擴增（紅(hong)色的酶(mei)切位(wei)點序列(lie)可以去除，按(an)實(shi)際需要處理）：

B.2.2   GFP用含(han)同源臂的引物擴增（紅色(se)的酶切位(wei)點序(xu)列(lie)可以去除，按實(shi)際需要處理(li)）：

C.重(zhong)組反應體系(xi)

※ ng和pmol轉換公式： ng =0.66   × 片段長(chang)度 ×pmol (以上(shang)(shang)體系0.03 pmol即(ji)加入 [0.02 ×長(chang)度]   ng；以上(shang)(shang)體系0.06 pmol就是加入 [0.04 ×長(chang)度]   ng)

D.重(zhong)組反應條件

單片段重組(zu)反應，50℃反應5分鐘(zhong)，之后放入4度或者冰浴(yu)中；

多片段(duan)重組反應，50℃反應15分鐘(zhong)，之后放(fang)入4度或者冰浴中。

E.重組反應產物轉化

（使用化學感(gan)受態可參照以下步驟，或以使用的(de)感(gan)受態說明書(shu)為準）

E.1在冰上解(jie)凍克隆感(gan)受(shou)態細(xi)胞,取10 μl重組產物加(jia)入到(dao)100 μl感(gan)受(shou)態細(xi)胞中，輕(qing)彈管(guan)壁混(hun)勻，冰上靜(jing)置30 min。

E.2   42℃水浴熱激45秒(miao)，立即冰上冷卻2-3分鐘。加900 μl SOC或(huo)LB培養基(不添加抗生(sheng)素)，37℃搖菌(jun)1小(xiao)時(轉(zhuan)速200 - 250 rpm)。

E.3將相應(ying)抗性(xing)的(de)LB平板固體培(pei)養(yang)基(ji)在37℃培(pei)養(yang)箱(xiang)中(zhong)預熱(re)。5,000rpm離心5 min，棄(qi)掉900 μl上清(qing)。用剩余培(pei)養(yang)基(ji)將菌體重懸，用無菌涂布(bu)棒在含有(you)正確抗性(xing)的(de)平板上輕(qing)輕(qing)涂勻。

E.4   37℃培(pei)養箱中(zhong)倒置培(pei)養12-16 h。

F.克隆鑒(jian)定

PCR鑒定/酶切鑒定/測(ce)序(xu)

本品僅供科研使用(yong)(yong)，不(bu)能(neng)用(yong)(yong)于人和動(dong)物醫療診(zhen)斷(duan)