PCR Master Mix的成分(fen)及使用(yong)簡介

進行PCR試(shi)驗(yan)時，往往要向PCR管(guan)中加(jia)入buffer、dNTP、DNA酶、引物、模板、水等各種PCR反(fan)應所需的(de)試(shi)劑，而(er)在加(jia)入這些(xie)試(shi)劑時如(ru)果操作(zuo)不規范很(hen)容易造成(cheng)污染，導致PCR結果不準(zhun)確，因此，為了簡化反(fan)復添加(jia)各種試(shi)劑便將(jiang)buffer、dNTP、DNAPolymerase等試(shi)劑先混合到一起，即配制成(cheng)Master Mix然后再使用，即簡化了PCR操作(zuo)步(bu)驟，也減少了污染的(de)途(tu)經(jing)。

一、簡介：

2×PCR Master Mix中(zhong)(zhong)含有2×TaqDNA Polymerase，2×PCR Buffer，2×dNTP，只需(xu)加(jia)入適(shi)量引物(wu)、模(mo)板(ban)和水即(ji)可(ke)進行(xing)PCR擴增。大大簡(jian)化了PCR操(cao)作(zuo)，使操(cao)作(zuo)更(geng)加(jia)快捷(jie)，也減少了PCR操(cao)作(zuo)過程中(zhong)(zhong)可(ke)能(neng)導致的污染，使PCR的重復性更(geng)好(hao)。

利(li)用2×PCR Master Mix可以(yi)(yi)進(jin)行各種(zhong)常(chang)規的PCR擴增(zeng)，特別(bie)適合用于定量和半(ban)定量的PCR擴增(zeng)，以(yi)(yi)及2kb以(yi)(yi)下(xia)DNA片斷的T載體克隆。

2×PCRMasterMix可以(yi)擴增(zeng)出(chu)長(chang)達8kb的(de)片斷，但通(tong)常更適合用(yong)于擴增(zeng)2kb以(yi)下的(de)DNA片斷。可以(yi)選用(yong)新貝生物-NovaBio的(de)2×Ultra Taq PCR Mix (shpusheng.cn/pd.jsp?id=37)

二、保存條件(jian)：-20℃保存。

三、注意事項：

1、由于PCR反應非常靈敏可以擴(kuo)增目的基(ji)因序列超過1000萬倍，在使用Taq酶時請(qing)注意避免微量(liang)待(dai)擴(kuo)增DNA的污(wu)染(ran)，并盡量(liang)考慮設置不加(jia)模板(ban)的空白對照以確認是(shi)否有待(dai)擴(kuo)增DNA的污(wu)染(ran)。

2、Taq DNApolymerase在PCR過程中每(mei)循環的出錯幾率約(yue)為2.2x10^-5，對于(yu)(yu)(yu)大(da)于(yu)(yu)(yu)1kb的DNA片斷(duan)的克(ke)隆推薦使用出錯幾(ji)率更低的DNA聚合酶，例如Pfu DNA polymerase、G5 DNA polymerase、ultra DNA polymerase等。對于(yu)(yu)(yu)普通的PCR或(huo)RT-PCR定(ding)性檢測或(huo)定(ding)量檢測，TaqDNA polymerase是最佳選(xuan)擇。

3、為了(le)您的安(an)全和健康(kang)，請穿實驗服并戴(dai)一次性手套操作。

四：體系配置(zhi)

2×UltraTaq PCR Mix冰(bing)上解凍(dong)后混勻備用(yong)，在冰(bing)上依次加入以下組分：

DNasefree H2O                             補足至 50^※μL                      補足(zu)至 20^※ μL              補足至 10^※ μL

上(shang)游引物(wu)（10 μM）                                     1μL                                        0.4 μL                       0.2 μL

下游(you)引物（10 μM）                                     1μL                                        0.4 μL                       0.2 μL

模板(ban)                                                        X* μL                                         X* μL                               X* μL

2×UltraTaq PCR Mix                                      25 μL                                         10 μL                        5 μL

※可以等比例降低體(ti)系體(ti)積(ji)，但不要小(xiao)于10 μL。

*加入(ru)模板量(liang)一般真核(he)基因(yin)組10 - 100 ng，細菌基因(yin)組1 - 10 ng，質(zhi)粒0.1 - 1 ng，未稀釋cDNA體(ti)積(ji)不要(yao)超過體(ti)系的1/10體(ti)積(ji)。

五、常(chang)見問題：

1.PCR產物(wu)非(fei)常少或沒有特異性條(tiao)帶。

a.引(yin)(yin)(yin)(yin)物(wu)(wu)設計不佳(jia)是PCR過程中最常見的(de)問(wen)題。請選擇適(shi)當的(de)引(yin)(yin)(yin)(yin)物(wu)(wu)設計軟件(jian)進行引(yin)(yin)(yin)(yin)物(wu)(wu)設計，注意引(yin)(yin)(yin)(yin)物(wu)(wu)的(de)GC含(han)量(liang)、二級(ji)結(jie)(jie)構(gou)(gou)、二聚體(ti)、退火溫(wen)(wen)度(du)、長度(du)、特異性(xing)等(deng)(deng)方面(mian)的(de)問(wen)題。在加入(ru)酶切位點(dian)等(deng)(deng)的(de)引(yin)(yin)(yin)(yin)物(wu)(wu)中，一定要注意加入(ru)酶切位點(dian)等(deng)(deng)后整條(tiao)引(yin)(yin)(yin)(yin)物(wu)(wu)的(de)GC含(han)量(liang)、二級(ji)結(jie)(jie)構(gou)(gou)、二聚體(ti)、退火溫(wen)(wen)度(du)、長度(du)、特異性(xing)等(deng)(deng)方面(mian)的(de)問(wen)題。在原有引(yin)(yin)(yin)(yin)物(wu)(wu)效果(guo)不佳(jia)的(de)情況并(bing)且(qie)陽(yang)性(xing)對照引(yin)(yin)(yin)(yin)物(wu)(wu)可以正常工(gong)作的(de)情況下，可以考慮(lv)更(geng)換(huan)引(yin)(yin)(yin)(yin)物(wu)(wu)。

b.待擴增(zeng)片斷GC含量(liang)偏(pian)高(gao)。GC含量(liang)較高(gao)的情況下PCR會變得相對(dui)比較困難，此時可以(yi)使用適合擴增(zeng)高(gao)GC含量(liang)DNA片斷的GC-richbuffer，并相應(ying)地根據GC-rich buffer的要求(qiu)或(huo)說明調整PCR反應(ying)參數(shu)的設置，可以(yi)使用新(xin)貝生(sheng)物-NovaBio的PCR GC Enhancer(shpusheng.cn/pd.jsp?id=67)。

c.長片(pian)斷(duan)擴增(zeng)(zeng)。盡管Taq DNApolymerase可以(yi)擴增(zeng)(zeng)最(zui)長達(da)8kb的(de)DNA片(pian)斷(duan)，但大多數時候比較適合擴增(zeng)(zeng)3kb以(yi)下的(de)片(pian)斷(duan)，更長片(pian)斷(duan)的(de)擴增(zeng)(zeng)推薦(jian)使用其它更適合長片(pian)斷(duan)擴增(zeng)(zeng)的(de)DNA聚合酶，可以(yi)使用新貝生(sheng)物-NovaBio的(de)高保真酶Mix - 2×G5 High-Fidelity PCRMix(shpusheng.cn/pd.jsp?id=33)。

d.PCR反應(ying)設置(zhi)時在室溫進行(xing)容易導致非特異性條件。推薦在冰浴(yu)上設置(zhi)PCR反應(ying)。

e.由(you)于引物存在一(yi)定的(de)二(er)級結構或存在一(yi)定的(de)引物二(er)聚體，或引物偏(pian)短(duan)，導(dao)致(zhi)退(tui)(tui)火(huo)(huo)(huo)效果不佳。此時可以采用(yong)Touch down等(deng)方(fang)法進行退(tui)(tui)火(huo)(huo)(huo)，通常采用(yong)從(cong)65℃逐(zhu)步(bu)緩慢降溫(wen)到55或50℃的(de)方(fang)法，使退(tui)(tui)火(huo)(huo)(huo)更加充分。

f.退火(huo)溫(wen)度(du)不(bu)佳，需要優化。如果有溫(wen)度(du)梯(ti)度(du)PCR儀，則可(ke)以設置(zhi)退火(huo)的溫(wen)度(du)梯(ti)度(du)，摸索(suo)退火(huo)的最佳溫(wen)度(du)。如果沒有溫(wen)度(du)梯(ti)度(du)PCR儀，則可(ke)以通過多次PCR反應摸索(suo)最佳的退火(huo)溫(wen)度(du)。

g.延(yan)伸時間(jian)不足(zu)。可按照每1kb片斷延(yan)伸1分鐘(zhong)進行設(she)(she)置，對于較難(nan)擴增(zeng)的片斷可以設(she)(she)置為每1kb片斷延(yan)伸1.5-2分鐘(zhong)。

h.待擴增(zeng)片(pian)斷GC含量(liang)較高或長(chang)度較長(chang)，變性(xing)不夠充分。可以調節起始變性(xing)條(tiao)件至95℃1min甚至95℃2-4min。

i.在(zai)不同PCR儀上進行PCR反應，避免有(you)時PCR儀出(chu)現(xian)問題(ti)。

j.循(xun)環(huan)數不(bu)足，適當延長PCR的(de)循(xun)環(huan)數。通常循(xun)環(huan)數最(zui)高不(bu)必超(chao)過40，常用的(de)循(xun)環(huan)數范圍為25-35。

k.模板含量太低，適當(dang)加大模板量，或(huo)采(cai)用(yong)(yong)巢式PCR(nested PCR)或(huo)二次(ci)PCR。巢式PCR即為(wei)在(zai)原(yuan)先設計(ji)的(de)PCR引(yin)物(wu)(wu)內側再(zai)(zai)設計(ji)一對(dui)PCR引(yin)物(wu)(wu)，然后對(dui)第(di)(di)一次(ci)PCR產(chan)物(wu)(wu)進行(xing)稀(xi)釋后再(zai)(zai)進行(xing)一次(ci)PCR擴(kuo)增(zeng)(zeng)，這樣一方面可以起(qi)到擴(kuo)增(zeng)(zeng)作用(yong)(yong)，同時也可以從(cong)第(di)(di)一次(ci)PCR產(chan)物(wu)(wu)中(zhong)擴(kuo)增(zeng)(zeng)出特異性條帶。二次(ci)PCR則為(wei)比較(jiao)簡單地(di)用(yong)(yong)原(yuan)有引(yin)物(wu)(wu)對(dui)第(di)(di)一次(ci)PCR產(chan)物(wu)(wu)進行(xing)稀(xi)釋后再(zai)(zai)進行(xing)一次(ci)PCR擴(kuo)增(zeng)(zeng)，可以起(qi)到擴(kuo)增(zeng)(zeng)作用(yong)(yong)，但不能去除非特異性條帶。

l.模板中(zhong)含有抑制PCR反應的(de)物質，可(ke)以(yi)用適當的(de)DNA純(chun)化(hua)方法例如柱(zhu)純(chun)化(hua)等純(chun)化(hua)模板DNA。

m.當(dang)產生較多(duo)非特異(yi)性條(tiao)帶時，可以(yi)適當(dang)提(ti)高退火(huo)溫度。

n.注(zhu)意(yi)設置適當的陽性對照和(he)陰性對照通常會有很大幫(bang)助。

PCR Master Mix現今已經廣(guang)泛應用在各種PCR實驗中，如Real Time PCR、多(duo)(duo)重(zhong)PCR、巢式PCR等。使用PCRMaster Mix即(ji)可(ke)以(yi)(yi)簡化實驗操作，又可(ke)以(yi)(yi)避(bi)免因多(duo)(duo)次對(dui)PCR管進行操作所造成的(de)污(wu)染(ran)問(wen)題。