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2× S6 miRNA SYBR qPCR Mix
貨 號(hao)：Q206
保存條件：- 20 ℃避(bi)光長期儲存；4℃避(bi)光存放6個月。
產品介(jie)紹：
本(ben)品(pin)(pin)為SYBR Green I 嵌合熒(ying)光(guang)(guang)法進行miRNA定(ding)量反應(ying)(ying)的(de)(de)(de)專用(yong)qPCR預(yu)混(hun)。該預(yu)混(hun)液包含(han)qPCR所需(xu)(xu)的(de)(de)(de)酶、dNTP、緩沖液、熒(ying)光(guang)(guang)染料(liao)、參(can)比染料(liao)等(deng)組分，使(shi)用(yong)時只需(xu)(xu)加(jia)入(ru)模板、引物、水即(ji)可(ke)，簡便易用(yong)。其中本(ben)品(pin)(pin)所使(shi)用(yong)的(de)(de)(de)聚(ju)合酶采用(yong)了國際領(ling)先的(de)(de)(de)啟動技術(shu)，較(jiao)之抗(kang)體封閉(bi)、化學(xue)修飾等(deng)熱啟動方式具有(you)封閉(bi)效率高，酶活釋放快(kuai)的(de)(de)(de)優勢。搭配(pei)針對qPCR精心優化的(de)(de)(de)緩沖體系，該預(yu)混(hun)液具有(you)靈敏度高，特(te)異性(xing)強、定(ding)量范圍廣、重(zhong)復(fu)性(xing)好(hao)的(de)(de)(de)特(te)點。另外本(ben)品(pin)(pin)預(yu)混(hun)了特(te)殊的(de)(de)(de)ROX參(can)比染料(liao)，可(ke)兼(jian)容所有(you)qPCR儀器，無(wu)需(xu)(xu)針對不同儀器額外添加(jia)相應(ying)(ying)的(de)(de)(de)ROX。推薦與本(ben)公司HyperScriptTM III miRNA 1st StrandcDNA Synthesis Kit(by stem-loop)(NovaBio # R601)配(pei)合使(shi)用(yong)。
產品(pin)組成：
溫馨提示：
·本(ben)品已預混(hun)適用所有qPCR儀器的ROX參比(bi)染(ran)料，無需額(e)外添(tian)加ROX；
·若解凍后管(guan)底出(chu)現白色或淡紅色沉(chen)淀，請顛倒(dao)混勻確保沉(chen)淀完全溶解后使(shi)用；
·本品(pin)含有熒光染(ran)料SYBR Green I，使用(yong)和(he)存儲時請避免(mian)強(qiang)光照射；
·配置反應液時，請使(shi)用滅菌槍(qiang)頭、Microtube等，同時避免產生氣泡；
產品使用：
A.推(tui)薦(jian)反應體系
2×S6 miRNA SYBR qPCR Mix 在冰上解凍后，混勻,按如下順序(xu)加樣(yang)：
注(zhu)：引物和(he)模板使用(yong)(yong)量(liang)請根據(ju)需要(yao)調整(zheng)，引物的終濃度范(fan)圍在0.1-1 μM，通常引物的使用(yong)(yong)量(liang)增加可以提高靈(ling)敏度（Ct減小）但同(tong)時(shi)會降低特(te)異(yi)性（出現引物二聚體等非特(te)異(yi)性產物）；未稀(xi)釋的cDNA的加入量(liang)不(bu)應(ying)超過總反應(ying)體積(ji)的1/10。
B.推薦反應程(cheng)序(xu)
注：預變(bian)性(xing)溫(wen)度(du)(du)和(he)時(shi)間(jian)可(ke)(ke)以根據模(mo)板復(fu)雜(za)度(du)(du)進行(xing)調整，如模(mo)板復(fu)雜(za)度(du)(du)較高(gao)(gao)可(ke)(ke)以提(ti)高(gao)(gao)預變(bian)性(xing)溫(wen)度(du)(du)并(bing)延長時(shi)間(jian)；對于長度(du)(du)小于200bp的(de)擴(kuo)增(zeng)子，可(ke)(ke)以使用(yong)快速程序(xu)，即變(bian)性(xing)時(shi)間(jian)3秒(miao)，退(tui)火(huo)和(he)延伸時(shi)間(jian)10秒(miao)。對于高(gao)(gao)GC的(de)擴(kuo)增(zeng)子，可(ke)(ke)提(ti)高(gao)(gao)退(tui)火(huo)延伸溫(wen)度(du)(du)至(zhi)65℃；循環數設(she)置為(wei)40-45可(ke)(ke)滿足絕大(da)多數的(de)反應；對于Tm較低的(de)引物(wu)，可(ke)(ke)使用(yong)三步(bu)法，比如退(tui)火(huo)溫(wen)度(du)(du)設(she)置在(zai)55℃，延伸溫(wen)度(du)(du)設(she)置為(wei)72℃，信號采集(ji)設(she)置在(zai)延伸步(bu)驟。
常見問題及解(jie)決方案：
問題 | 可能原因 | 解(jie)決方案 |
無擴增曲線 | 缺少qPCR反應必需組分(fen) | 確認(ren)是(shi)否加入適當的模(mo)板和引物 |
反(fan)應程序設置不正確 | 確認選(xuan)擇FAM/SYBR的檢(jian)測通(tong)道；確認信號采集設置正確，兩步法(fa)設置在退(tui)火延伸步驟(zou)，三步法(fa)設置在延伸步驟(zou) |
試劑存在污(wu)染或(huo)過(guo)期 | 更換新的試劑(ji) |
模板(ban)或引物(wu)存在降(jiang)解 | 更換新的模(mo)板(ban)或(huo)引物 |
模板(ban)投入量過低 | 適當提(ti)高模板投入量 |
加樣時帶入了PCR抑(yi)制物質 | 通常抑制(zhi)劑是模(mo)(mo)板純(chun)化時殘(can)留的物(wu)質，該情況可通過稀(xi)釋模(mo)(mo)板緩解；必要時可進一步純(chun)化模(mo)(mo)板 |
復(fu)孔(kong)重復(fu)性差 | 模板濃度(du)較(jiao)低，加樣不精確 | 請(qing)避免加(jia)(jia)入小體(ti)積的低(di)濃度(du)模(mo)板，該情況(kuang)下可以(yi)進一(yi)步(bu)稀釋模(mo)板后加(jia)(jia)入大體(ti)積 |
管材封閉性存在問題 | 上機(ji)前請確認PCR管(guan)(guan)已被封閉好(hao)，必要時更換管(guan)(guan)材 |
組分(fen)沒有充分(fen)混勻 | 請(qing)確保mix被充分混勻 |
PCR管中存在氣泡(pao) | 請避免(mian)出現氣泡 |
融解(jie)曲線(xian)不是(shi)單峰 | 出現Tm值低(di)于目(mu)的產(chan)物Tm值的融解峰，低(di)Tm值的峰一(yi)般(ban)為(wei)引物二聚(ju)體 | 通過NTC（不加模板的(de)control）確(que)認，NTC如出(chu)現同樣Tm值(zhi)較低的(de)融解峰則(ze)可確(que)認為由(you)引物二(er)聚體引起。可通過提高退火(huo)溫度(du)，重(zhong)新設計引物解決（避免上下游引物3’端互補(bu)配對(dui)） |
出現Tm值(zhi)高于目的(de)(de)產物的(de)(de)Tm值(zhi)的(de)(de)融(rong)解(jie)峰(feng)，一般(ban)認(ren)為是過度擴(kuo)增造成 | 可通過(guo)降低模板投入量，減(jian)少退火延(yan)伸時間解決 |
使(shi)用cDNA存在基因組污染(ran)或mRNA存在可變剪切 | 使用(yong)DNaseⅠ處理(li)模板或跨內含子(zi)設計引物；更(geng)換可以區(qu)分(fen)可變(bian)剪接(jie)的(de)引物。 |
極少數目的產物(wu)過長會分段解鏈形成雙峰(feng) | 除非必(bi)要，請盡量將擴增子的長度(du)控制(zhi)在70-200bp的范圍 |
標準曲線(xian)線(xian)性關系不佳 | 出現明顯異常(chang)的點（加樣(yang)或(huo)儀器不穩(wen)定造(zao)成） | 剔除異常點(dian)進行計算 |
標準品降解 | 更換新(xin)的(de)標準品 |
反應液中(zhong)引入了(le)抑制物 | 找(zhao)到抑(yi)制物來源，更換相應組分 |
NTC存在污染 | 更換試劑及實驗環(huan)境（可在紫外(wai)滅菌后的超凈臺(tai)操作） |
低模板量加樣存在(zai)誤差(cha) | 進(jin)一步(bu)稀釋低濃度模板后加入(ru)大(da)體積 |
與其他qPCR試(shi)劑相比，Tm值不同 | 不(bu)同廠(chang)家的buffer使(shi)用了不(bu)同的鹽離(li)子濃度 | 內參基因和目的基因使用同一品牌(pai)試劑即可進行(xing)相對定量(liang)，Tm絕(jue)對值沒(mei)有比較參考價(jia)值的。 |
是否需(xu)要冰(bing)上(shang)操(cao)作 |
| 本品(pin)含有的熱啟動Taq DNA Polymerase可(ke)避(bi)免室溫下(xia)引物的非特異性延伸，可(ke)以常溫配置體(ti)系(xi) |
是否兼容快(kuai)速程序 |
| 擴(kuo)增子在70-200bp時(shi)可(ke)使(shi)用(yong)快速程序，根(gen)據不同儀器可(ke)以節省(sheng)40%-60%的(de)時(shi)間，擴(kuo)增子>200bp時(shi)，請(qing)使(shi)用(yong)標準(zhun)程序。 |
本品僅供科研使(shi)用，不(bu)能用于人和動物(wu)醫療診(zhen)斷
