PCR Master Mix的成(cheng)分及使(shi)用簡(jian)介

進行PCR試驗時，往往要向(xiang)PCR管中加(jia)入buffer、dNTP、DNA酶、引物(wu)、模板(ban)、水等(deng)各(ge)種PCR反應(ying)所需的(de)試劑(ji)，而在加(jia)入這些試劑(ji)時如(ru)果操(cao)(cao)作不規(gui)范很容易造(zao)成污染(ran)，導致PCR結果不準確(que)，因此(ci)，為了(le)簡化反復添加(jia)各(ge)種試劑(ji)便將buffer、dNTP、DNAPolymerase等(deng)試劑(ji)先(xian)混合到一起(qi)，即(ji)配制成Master Mix然后再使用，即(ji)簡化了(le)PCR操(cao)(cao)作步驟，也(ye)減(jian)少了(le)污染(ran)的(de)途(tu)經。

一、簡介：

2×PCR Master Mix中含有2×TaqDNA Polymerase，2×PCR Buffer，2×dNTP，只需(xu)加入適量(liang)引物(wu)、模(mo)板和(he)水即可(ke)(ke)進(jin)行PCR擴增。大(da)大(da)簡化(hua)了PCR操(cao)(cao)作(zuo)，使操(cao)(cao)作(zuo)更(geng)加快捷(jie)，也減(jian)少(shao)了PCR操(cao)(cao)作(zuo)過程中可(ke)(ke)能(neng)導致(zhi)的(de)(de)污染，使PCR的(de)(de)重復性更(geng)好。

利(li)用2×PCR Master Mix可以(yi)進行各種(zhong)常(chang)規的PCR擴(kuo)增，特別適合用于定(ding)量和半定(ding)量的PCR擴(kuo)增，以(yi)及2kb以(yi)下DNA片斷(duan)的T載體克隆。

2×PCRMasterMix可(ke)(ke)以(yi)(yi)擴增出長達8kb的(de)片(pian)斷(duan)，但通常(chang)更(geng)適合(he)用(yong)于擴增2kb以(yi)(yi)下(xia)的(de)DNA片(pian)斷(duan)。可(ke)(ke)以(yi)(yi)選用(yong)新貝(bei)生(sheng)物-NovaBio的(de)2×Ultra Taq PCR Mix (shpusheng.cn/pd.jsp?id=37)

二、保存條件：-20℃保存。

三、注意事項：

1、由于PCR反應非(fei)常(chang)靈敏可以擴(kuo)增(zeng)目的基(ji)因序列(lie)超過1000萬(wan)倍，在使用Taq酶時(shi)請注意(yi)避免微量待擴(kuo)增(zeng)DNA的污染，并盡量考(kao)慮設置(zhi)不加模板(ban)的空白對照以確(que)認(ren)是否(fou)有待擴(kuo)增(zeng)DNA的污染。

2、Taq DNApolymerase在PCR過(guo)程(cheng)中每循環(huan)的出(chu)錯幾率約為2.2x10^-5，對于(yu)大于(yu)1kb的(de)DNA片斷的(de)克隆推薦使用(yong)出錯(cuo)幾率更(geng)低的(de)DNA聚合(he)酶，例如Pfu DNA polymerase、G5 DNA polymerase、ultra DNA polymerase等。對于(yu)普通(tong)的(de)PCR或(huo)RT-PCR定(ding)性檢測或(huo)定(ding)量檢測，TaqDNA polymerase是最佳選擇。

3、為(wei)了您的安全和健(jian)康，請穿實驗服(fu)并(bing)戴一次性手(shou)套操作(zuo)。

四：體系配置

2×UltraTaq PCR Mix冰(bing)上(shang)解(jie)凍后混(hun)勻備用，在冰(bing)上(shang)依次加入以下組(zu)分：

DNasefree H2O                             補(bu)足至 50^※μL                      補足至 20^※ μL              補足(zu)至 10^※ μL

上游引物（10 μM）                                     1μL                                        0.4 μL                       0.2 μL

下游引(yin)物(wu)（10 μM）                                     1μL                                        0.4 μL               ;        0.2 μL

模板                                                        X* μL                                         X* μL                               X* μL

2×UltraTaq PCR Mix                                      25 μL                                         10 μL                        5 μL

※可以等比例降(jiang)低體系(xi)體積，但不要小于10 μL。

*加入模板(ban)量一般真核基因(yin)組10 - 100 ng，細(xi)菌基因(yin)組1 - 10 ng，質粒0.1 - 1 ng，未(wei)稀釋cDNA體積不要超過(guo)體系的1/10體積。

五、常見問題：

1.PCR產(chan)物非常少或沒有特異性條帶。

a.引(yin)(yin)物(wu)設計不(bu)佳是PCR過程中最常(chang)見(jian)的(de)(de)(de)問題(ti)(ti)。請選擇(ze)適(shi)當的(de)(de)(de)引(yin)(yin)物(wu)設計軟件進(jin)行引(yin)(yin)物(wu)設計，注意(yi)(yi)引(yin)(yin)物(wu)的(de)(de)(de)GC含(han)量、二級(ji)結構(gou)、二聚(ju)體、退火溫度(du)、長度(du)、特異(yi)性等(deng)方(fang)(fang)面(mian)的(de)(de)(de)問題(ti)(ti)。在(zai)加(jia)入酶切位點等(deng)的(de)(de)(de)引(yin)(yin)物(wu)中，一定要注意(yi)(yi)加(jia)入酶切位點等(deng)后整條引(yin)(yin)物(wu)的(de)(de)(de)GC含(han)量、二級(ji)結構(gou)、二聚(ju)體、退火溫度(du)、長度(du)、特異(yi)性等(deng)方(fang)(fang)面(mian)的(de)(de)(de)問題(ti)(ti)。在(zai)原有引(yin)(yin)物(wu)效果不(bu)佳的(de)(de)(de)情況并且陽性對照(zhao)引(yin)(yin)物(wu)可(ke)以正常(chang)工作的(de)(de)(de)情況下，可(ke)以考慮(lv)更換引(yin)(yin)物(wu)。

b.待擴(kuo)增片斷(duan)GC含(han)量(liang)偏高。GC含(han)量(liang)較(jiao)高的情(qing)況下PCR會(hui)變(bian)得相對比較(jiao)困難，此時可以使(shi)用(yong)適合擴(kuo)增高GC含(han)量(liang)DNA片斷(duan)的GC-richbuffer，并相應地(di)根據GC-rich buffer的要求(qiu)或(huo)說明(ming)調整PCR反應參(can)數的設置，可以使(shi)用(yong)新貝生(sheng)物(wu)-NovaBio的PCR GC Enhancer(shpusheng.cn/pd.jsp?id=67)。

c.長片(pian)斷(duan)擴(kuo)增(zeng)(zeng)(zeng)。盡(jin)管Taq DNApolymerase可以擴(kuo)增(zeng)(zeng)(zeng)最長達8kb的(de)(de)DNA片(pian)斷(duan)，但大多數時候比(bi)較適合擴(kuo)增(zeng)(zeng)(zeng)3kb以下的(de)(de)片(pian)斷(duan)，更長片(pian)斷(duan)的(de)(de)擴(kuo)增(zeng)(zeng)(zeng)推薦使用(yong)其它(ta)更適合長片(pian)斷(duan)擴(kuo)增(zeng)(zeng)(zeng)的(de)(de)DNA聚合酶(mei)，可以使用(yong)新貝(bei)生物(wu)-NovaBio的(de)(de)高保真酶(mei)Mix - 2×G5 High-Fidelity PCRMix(shpusheng.cn/pd.jsp?id=33)。

d.PCR反應設置(zhi)時在室溫進行容易導致非特異性條件。推(tui)薦在冰浴上設置(zhi)PCR反應。

e.由于引(yin)物存在一定的(de)二級(ji)結構或(huo)存在一定的(de)引(yin)物二聚體，或(huo)引(yin)物偏短，導致退(tui)火(huo)效果不(bu)佳。此時(shi)可以采用Touch down等(deng)方法(fa)進(jin)行(xing)退(tui)火(huo)，通常采用從65℃逐步緩慢降溫到55或(huo)50℃的(de)方法(fa)，使退(tui)火(huo)更(geng)加(jia)充分。

f.退火(huo)(huo)溫(wen)度(du)(du)(du)不佳(jia)，需要(yao)優化(hua)。如果有(you)溫(wen)度(du)(du)(du)梯度(du)(du)(du)PCR儀(yi)，則可以(yi)設置退火(huo)(huo)的(de)溫(wen)度(du)(du)(du)梯度(du)(du)(du)，摸索(suo)退火(huo)(huo)的(de)最(zui)佳(jia)溫(wen)度(du)(du)(du)。如果沒(mei)有(you)溫(wen)度(du)(du)(du)梯度(du)(du)(du)PCR儀(yi)，則可以(yi)通(tong)過多(duo)次PCR反應(ying)摸索(suo)最(zui)佳(jia)的(de)退火(huo)(huo)溫(wen)度(du)(du)(du)。

g.延(yan)伸(shen)時間不(bu)足。可按(an)照(zhao)每1kb片斷延(yan)伸(shen)1分(fen)鐘(zhong)進行設置，對于較難(nan)擴增的片斷可以設置為每1kb片斷延(yan)伸(shen)1.5-2分(fen)鐘(zhong)。

h.待(dai)擴增片(pian)斷(duan)GC含量較高(gao)或長度較長，變(bian)性不夠充分(fen)。可以調(diao)節(jie)起始變(bian)性條(tiao)件至95℃1min甚至95℃2-4min。

i.在(zai)不同(tong)PCR儀上進(jin)行PCR反應，避免(mian)有時PCR儀出現(xian)問(wen)題。

j.循環(huan)(huan)數不足(zu)，適當延(yan)長PCR的(de)循環(huan)(huan)數。通(tong)常循環(huan)(huan)數最高不必超過40，常用的(de)循環(huan)(huan)數范圍為25-35。

k.模板含量(liang)(liang)太低，適(shi)當加(jia)大模板量(liang)(liang)，或(huo)(huo)采用巢(chao)式PCR(nested PCR)或(huo)(huo)二次(ci)(ci)PCR。巢(chao)式PCR即為在原(yuan)先設計的PCR引(yin)物內側再(zai)(zai)設計一(yi)(yi)(yi)對(dui)PCR引(yin)物，然(ran)后(hou)(hou)(hou)對(dui)第一(yi)(yi)(yi)次(ci)(ci)PCR產(chan)物進(jin)行稀(xi)釋后(hou)(hou)(hou)再(zai)(zai)進(jin)行一(yi)(yi)(yi)次(ci)(ci)PCR擴(kuo)(kuo)增(zeng)，這樣一(yi)(yi)(yi)方面可(ke)(ke)以起到擴(kuo)(kuo)增(zeng)作(zuo)用，同(tong)時也可(ke)(ke)以從(cong)第一(yi)(yi)(yi)次(ci)(ci)PCR產(chan)物中擴(kuo)(kuo)增(zeng)出(chu)特異性(xing)條(tiao)帶(dai)。二次(ci)(ci)PCR則(ze)為比(bi)較(jiao)簡單地用原(yuan)有引(yin)物對(dui)第一(yi)(yi)(yi)次(ci)(ci)PCR產(chan)物進(jin)行稀(xi)釋后(hou)(hou)(hou)再(zai)(zai)進(jin)行一(yi)(yi)(yi)次(ci)(ci)PCR擴(kuo)(kuo)增(zeng)，可(ke)(ke)以起到擴(kuo)(kuo)增(zeng)作(zuo)用，但(dan)不能(neng)去除非特異性(xing)條(tiao)帶(dai)。

l.模板中含有抑制PCR反(fan)應的物質，可以用適當的DNA純(chun)化(hua)方法例如柱純(chun)化(hua)等純(chun)化(hua)模板DNA。

m.當產生較多非特(te)異性條帶時，可以(yi)適當提高(gao)退火(huo)溫度。

n.注(zhu)意設置(zhi)適當的陽性對照和(he)陰(yin)性對照通常會有很(hen)大幫助。

PCR Master Mix現今(jin)已經廣泛應用在各(ge)種PCR實(shi)驗中，如Real Time PCR、多重PCR、巢式PCR等。使用PCRMaster Mix即可以簡化實(shi)驗操作，又可以避免因(yin)多次對(dui)PCR管進(jin)行操作所(suo)造成的(de)污染問題。