聚合酶鏈反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）是 80 年代中期發展起來的體外(wai)核酸擴(kuo)增技術。它具有特異、敏感、產率高、快速、簡便、重復性好(hao)、易自動(dong)化(hua)等(deng)突出優點。

一

PCR 實驗步驟

PCR 反應試劑

DNA 模板

與特定 DNA 模板結合的(de)引物(wu)

去離子水

商業化的 DNA 聚合酶以及緩沖液

dNTP

MgSO4（可選）

DMSO（可選）

PCR 反應準備工作

PCR 反應開(kai)始前(qian)，你需要準(zhun)備好 DNA 模板（基因組 DNA 或者反轉錄制備的(de)(de)(de)(de) cDNA）, 特異性(xing)的(de)(de)(de)(de)引物（手動設計或利用軟件設計）并選擇合適的(de)(de)(de)(de)商業(ye)化 DNA 聚合酶（根(gen)據實驗的(de)(de)(de)(de)目(mu)的(de)(de)(de)(de)不同做出決定）。

DNA 聚合酶的選擇

市面上有(you)多種 DNA 聚合酶可供選(xuan)擇(ze)，他(ta)們的(de)特性(xing)(xing)也各(ge)有(you)不(bu)同(tong)。因(yin)此你(ni)需要選(xuan)擇(ze)最適合自己實驗(yan)需要的(de)產品(pin)。通(tong)常我們將(jiang) DNA 聚合酶分為高保真(zhen)性(xing)(xing)聚合酶和(he)普(pu)通(tong)的(de) Taq 聚合酶。如果你(ni)希望得到沒有(you)任何突變的(de) PCR 產物，那應當(dang)選(xuan)擇(ze)高保真(zhen)聚合酶。若你(ni)只是(shi)希望判斷特異性(xing)(xing)序列的(de)存(cun)在(zai)與否，那普(pu)通(tong)的(de) Taq 聚合酶已經足夠。

另外要注(zhu)意的(de)(de)(de)一(yi)點是，進行 T 載體(ti)連(lian)接的(de)(de)(de)時(shi)候，要了解高保真的(de)(de)(de)聚合酶所(suo)得(de)的(de)(de)(de)產物是沒有 A 末端的(de)(de)(de)，因此你在 T 載體(ti)連(lian)接之前需要進行加 A 反應(ying)。或者(zhe)直接選用(yong)普通的(de)(de)(de) Taq 聚合酶。

引物

引(yin)物(wu)特異性會影響到 PCR 反應(ying)成功的可能(neng)性，好的引(yin)物(wu)設(she)計(ji)對 PCR 成功至關重要。設(she)計(ji)引(yin)物(wu)時，有(you)以(yi)下幾條原則需要謹慎考慮：

1. 引(yin)物(wu)(wu)(wu)長度(du)。通常 PCR 引(yin)物(wu)(wu)(wu)長度(du)在 18~22 個堿基之間(jian)。這(zhe)對引(yin)物(wu)(wu)(wu)的特異性以及退火溫度(du)而言均(jun)已足夠。

2. 解鏈(lian)溫度 （Tm）。Tm 值(zhi)的定義是使得(de)一半(ban)雙鏈(lian) DNA 解螺旋成為單鏈(lian) DNA 的溫度。引(yin)物的 Tm 值(zhi)通(tong)常要在 52~58 ℃ 之間(jian)。

3. GC 含(han)量(liang)(liang)。最適合的(de) GC 含(han)量(liang)(liang)為 40~60%。

就目前而言(yan)很多軟件(jian)都可以(yi)用來(lai)設計引(yin)物(wu)，如 primer 5 和 Oligo。通常這些軟件(jian)設計得到的(de)引(yin)物(wu)均可以(yi)滿足需(xu)要。

PCR 操作流程

PCR 由變性(xing)——退火——延伸(shen)三個(ge)基本反(fan)應(ying)步(bu)驟構成(cheng)。

準備好各種(zhong)試(shi)劑(ji)和 PCR 儀，就(jiu)可(ke)以開始 PCR 實驗：將(jiang)各種(zhong)試(shi)劑(ji)混(hun)合(he)并按照說(shuo)明書設置 PCR 反應。一般 PCR 循(xun)環如(ru)下：

1. 起始步驟：這對于(yu)熱(re)啟動 PCR 而(er)言(yan)是必(bi)須的，將反應混(hun)合液(ye)加熱(re)至 94~98 ℃ 以激活 DNA 聚合酶(mei)。這一(yi)步的時(shi)間取決于(yu)所選用的 DNA 聚合酶(mei)。

2. 變性步驟：DNA 本身(shen)是雙鏈結(jie)(jie)構，而(er) DNA 擴增(zeng)需(xu)要引物(wu)與單鏈 DNA 模板(ban)相結(jie)(jie)合。在這(zhe)(zhe)一(yi)步，反應混(hun)合液被加熱至 94～98 ℃ 保持 20～30 秒以破(po)壞雙鏈間的氫(qing)鍵(jian)以便(bian)釋放出單鏈 DNA。這(zhe)(zhe)是 PCR 循(xun)環中(zhong)的第(di)一(yi)步。

3. 退(tui)火步驟：變(bian)性之后，DNA 模(mo)(mo)板(ban)以單鏈的(de)(de)形式在(zai)(zai)反應混合(he)液中(zhong)存在(zai)(zai)。因為反應體系中(zhong)的(de)(de)引(yin)物(wu)(wu)與(yu) DNA 模(mo)(mo)板(ban)互(hu)(hu)補，當反應溫度降(jiang)至 50~65 ℃ 時，引(yin)物(wu)(wu)與(yu)互(hu)(hu)補的(de)(de)序(xu)列形成氫鍵。退(tui)火溫度主(zhu)要取決于(yu)引(yin)物(wu)(wu)的(de)(de) Tm 值(zhi)(zhi)，通常比引(yin)物(wu)(wu) Tm 值(zhi)(zhi)低 3～5 ℃。這一步通常維持 20～40 秒，而聚合(he)酶(mei)會結合(he)至引(yin)物(wu)(wu)-模(mo)(mo)板(ban)雙(shuang)鏈處開始 DNA 合(he)成。

4. 延伸步(bu)驟：在這一(yi)步(bu)，DNA 聚合(he)酶開始 DNA 合(he)成(cheng)，因此這一(yi)步(bu)的(de)(de)溫(wen)度選取的(de)(de)是 DNA 聚合(he)酶的(de)(de)最優溫(wen)度。通(tong)常我們(men)選用 72 ℃，但某些 DNA 聚合(he)酶的(de)(de)最適溫(wen)度是 68 ℃。這一(yi)步(bu)與體(ti)內的(de)(de) DNA 復制很相(xiang)似：DNA 聚合(he)酶按照(zhao)堿基互補(bu)規(gui)律將 dNTPs 加到(dao)引物(wu)的(de)(de) 3’ 末端(duan)最終得到(dao)新的(de)(de) DNA 雙鏈片段。延伸時間取決于目的(de)(de) DNA 片段的(de)(de)長度和 DNA 聚合(he)酶的(de)(de)合(he)成(cheng)能(neng)力(li)。一(yi)般而言 DNA 聚合(he)酶每(mei) 60 秒能(neng)夠(gou)合(he)成(cheng) 1 kb 長度的(de)(de) DNA。

5. 循環：第 2 步(bu)至第 4 步(bu)稱(cheng)為一個循環。每次(ci)(ci)循環之后(hou) DNA 的量均是(shi)前一次(ci)(ci)的兩倍。通常一次(ci)(ci) PCR 反(fan)應進(jin)行 30~35 個循環。在前幾輪的 PCR 循環過程中 PCR 產物的量以指(zhi)數(shu)速(su)率(lv)(lv)增(zeng)長(chang)，但(dan)是(shi)到了反(fan)應后(hou)期(qi)隨著 dNTPs 和引(yin)物的量的減少(shao)以及(ji) DNA 聚合(he)酶的失活，反(fan)應速(su)率(lv)(lv)逐(zhu)漸下降，因此 PCR 反(fan)應的產量也受到了限制。

6. 最(zui)后的(de)延伸(shen)步(bu)驟：當 30~35 個循(xun)環結束后，我(wo)們通常(chang)會以 68~74 ℃ 延伸(shen) 5~10 分鐘，這是希望使(shi)反應(ying)體系中殘(can)留(liu)的(de)單鏈 DNA 全部反應(ying)完畢。

7. 保存溫(wen)度(du)：通常我(wo)們(men)設置 4~10 ℃ 為反應后 PCR 產物的保存溫(wen)度(du)。

每完成(cheng)一(yi)個循環需 2～4 分鐘，2～3 小時就能(neng)將待擴(kuo)目(mu)的(de)基因(yin)擴(kuo)增(zeng)放(fang)大幾百萬(wan)倍。到達(da)平臺期 (Plateau) 所需循環次(ci)數取決于樣品(pin)中模板的(de)拷貝。PCR 的(de)反(fan)應動力(li)學 PCR 的(de)三個反(fan)應步(bu)驟反(fan)復進行(xing)，使 DNA 擴(kuo)增(zeng)量呈指數上升。

反(fan)應最(zui)終(zhong)的(de) DNA 擴增(zeng)量可用(yong) Y=(1+X)n 計算。Y 代表 DNA 片段擴增(zeng)后的(de)拷貝數(shu)，X 表示平均每次的(de)擴增(zeng)效(xiao)率，n 代表循環次數(shu)。平均擴增(zeng)效(xiao)率的(de)理論值(zhi)為 100%，但在實際反(fan)應中平均效(xiao)率達不(bu)到理論值(zhi)。

反應初期，靶(ba)序列(lie) DNA 片段的增加(jia)呈指數形式，隨著 PCR 產物的逐漸(jian)積累(lei)，被(bei)擴增的 DNA 片段不再呈指數增加(jia)，而進(jin)入(ru)線性(xing)增長期或靜止期，即出現「停滯效(xiao)應」，這種(zhong)(zhong)效(xiao)應稱平(ping)臺期數、PCR 擴增效(xiao)率及 DNA 聚合(he)酶 PCR 的種(zhong)(zhong)類和活(huo)性(xing)及非特異性(xing)產物的竟爭(zheng)等因(yin)素。

PCR 擴增(zeng)產(chan)物(wu)可(ke)分為長(chang)產(chan)物(wu)片(pian)段(duan)(duan)和短產(chan)物(wu)片(pian)段(duan)(duan)兩(liang)部分。短產(chan)物(wu)片(pian)段(duan)(duan)的(de)長(chang)度嚴(yan)格(ge)地限定(ding)在兩(liang)個引(yin)物(wu)鏈 5’ 端(duan)之間(jian)，是需要擴增(zeng)的(de)特(te)定(ding)片(pian)段(duan)(duan)。短產(chan)物(wu)片(pian)段(duan)(duan)和長(chang)產(chan)物(wu)片(pian)段(duan)(duan)是由于引(yin)物(wu)所結合的(de)模(mo)板不一樣而形(xing)成的(de)。

以(yi)一個原(yuan)(yuan)始(shi)模板(ban)(ban)為例(li)，在第(di)一個反(fan)應(ying)周(zhou)期(qi)中，以(yi)兩條互補的(de)(de) DNA 為模板(ban)(ban)，引(yin)物(wu)(wu)(wu)是從 3’ 端開始(shi)延伸，其 5’ 端是固定的(de)(de)，3’ 端則沒有(you)固定的(de)(de)止(zhi)點(dian)(dian)，長(chang)短(duan)(duan)不一，這(zhe)就(jiu)是「長(chang)產物(wu)(wu)(wu)片段」。進入第(di)二周(zhou)期(qi)后，引(yin)物(wu)(wu)(wu)除與原(yuan)(yuan)始(shi)模板(ban)(ban)結合(he)外，還要同新合(he)成(cheng)的(de)(de)鏈(lian) (即「長(chang)產物(wu)(wu)(wu)片段」) 結合(he)。引(yin)物(wu)(wu)(wu)在與新鏈(lian)結合(he)時，由(you)于新鏈(lian)模板(ban)(ban)的(de)(de) 5’ 端序列是固定的(de)(de)，這(zhe)就(jiu)等(deng)于這(zhe)次延伸的(de)(de)片段 3’ 端被(bei)固定了止(zhi)點(dian)(dian)，保證(zheng)了新片段的(de)(de)起點(dian)(dian)和止(zhi)點(dian)(dian)都(dou)限定于引(yin)物(wu)(wu)(wu)擴增(zeng)序列以(yi)內、形成(cheng)長(chang)短(duan)(duan)一致的(de)(de)「短(duan)(duan)產物(wu)(wu)(wu)片段」。

不(bu)(bu)難看出(chu)「短產物(wu)片(pian)段」是按指數(shu)倍數(shu)增加(jia)，而「長產物(wu)片(pian)段」則以算(suan)術(shu)倍數(shu)增加(jia)，幾乎可(ke)以忽略不(bu)(bu)計，這使得(de) PCR 的反應產物(wu)不(bu)(bu)需要再純(chun)化，就能保證足(zu)夠純(chun) DNA 片(pian)段供分析與(yu)檢測用(yong)。

二

PCR 常見(jian)問題原因及對策

無擴增條帶

1. 酶(mei)(mei)失(shi)活(huo)或(huo)在反應體系中未加入(ru)酶(mei)(mei)。TaqDNA 聚(ju)合酶(mei)(mei)因(yin)保存或(huo)運輸不當而失(shi)活(huo)，往往通過更換新酶(mei)(mei)或(huo)用(yong)另一來源的酶(mei)(mei)以獲得滿意的結果。

2. 模板含有(you)雜質。特別是對甲醛固(gu)定(ding)及石蠟包埋的組織常含甲酸，造成 DNA 脫嘌呤而影(ying)響 PCR 的結果(guo)。

3. 變(bian)性溫(wen)度是否準確(que)：PCR 儀指示溫(wen)度與(yu)實際溫(wen)度是否相符，過(guo)高酶(mei)在前幾個(ge)循環(huan)就迅速失活(huo)；過(guo)低則模板(ban)變(bian)性不徹(che)底。

4. 反應系統中污染(ran)了蛋白酶(mei)及核酸酶(mei)，應在未加 Taq 酶(mei)以(yi)前，將反應體(ti)系 95 ℃ 加熱 5~10 分鐘。

5. 引物變質失效。人(ren)工(gong)合(he)成(cheng)的引物是(shi)否正確。是(shi)否純化，或因儲存(cun)條件(jian)不當而失活。

6. 引(yin)物錯誤(wu)。利(li)用 BLAST 檢查引(yin)物特異性或重新設計(ji)引(yin)物。

7. DNA 凝膠電(dian)泳(yong)時(shi)加入陽性對照，確保不是 DNA 凝膠和(he) PCR 程序的問題。

PCR 產物量過少

1. 退火溫(wen)(wen)度不合(he)適。以 2 ℃ 為梯(ti)度設計梯(ti)度 PCR 反(fan)應優化退火溫(wen)(wen)度。

2. DNA 模板量太少。增加 DNA 模板量。

3. PCR 循(xun)環數不(bu)足(zu)。增加反應(ying)循(xun)環數。

4. 引物(wu)量(liang)不足。增加體(ti)系中引物(wu)含(han)量(liang)。

5. 延伸時間太短。以 1 kb/分(fen)鐘的原則設(she)置延伸時間。

6. 變性(xing)(xing)時(shi)間過長。變性(xing)(xing)時(shi)間過長會導(dao)致 DNA 聚(ju)合(he)酶失(shi)活。

7. DNA 模(mo)板中(zhong)存在抑制劑。確保 DNA 模(mo)板干凈。

擴增產物在凝膠呈彌散狀

1. 酶(mei)量(liang)(liang)過高。減少酶(mei)量(liang)(liang)；酶(mei)的質(zhi)量(liang)(liang)差，調換另一來源的酶(mei)。

2. dNTP 濃度過高。減少 dNTP 的(de)濃度。

3. MgCl2 濃度(du)過高(gao)。可適(shi)當降低其用量。

4. 模板量(liang)過多。質粒 DNA 的用(yong)量(liang)應 < 50 ng，而基因組 DNA 則(ze)應 < 200 ng。

5. 引物濃度不夠優化(hua)。對(dui)引物進行(xing)梯(ti)度稀釋(shi)重復 PCR 反應(ying)。

6. 循(xun)環次數過多。增加模板量減(jian)少循(xun)環次數至 30，縮短退火時(shi)間及延伸時(shi)間，或改用兩種溫度(du)的(de) PCR 循(xun)環。

7. 退火溫度過低。

8. 電泳體系有問題：

   ① 凝膠中緩沖液(ye)(ye)和(he)電泳緩沖液(ye)(ye)濃度相(xiang)差太大；

   ② 凝(ning)膠沒有凝(ning)固好；

   ③ 瓊脂糖質量差。

9. 若(ruo)為 PCR 試劑盒則(ze)可能：

   ① 由于運(yun)輸儲(chu)存(cun)不當(dang)引起試劑盒(he)失效；

   ② 試(shi)劑盒本身(shen)質量有問題，如引物選擇、循環參(can)數等(deng)選擇不(bu)當。

10. 降解的陳(chen)舊模板擴增也易(yi)產生涂布。

    

擴增產物出現多條帶（雜帶）

1. 引(yin)物(wu)用量偏大，引(yin)物(wu)的特異性(xing)不高。應調(diao)換引(yin)物(wu)或降低(di)引(yin)物(wu)的使用量。

2. 循(xun)環的次數(shu)過多。適當(dang)增加模板的量，減少循(xun)環次數(shu)。

3. 酶的(de)用量偏(pian)高或酶的(de)質量不好(hao)，應降(jiang)低酶量或調換另(ling)一來源的(de)酶。

4. 退(tui)火溫(wen)度(du)(du)(du)偏低，退(tui)火及延伸時間(jian)偏長(chang)。應提高退(tui)火溫(wen)度(du)(du)(du)，減少變性與延伸時間(jian)，也(ye)可采用二種溫(wen)度(du)(du)(du)的(de) PCR 擴增。以 2 ℃ 為梯(ti)度(du)(du)(du)設計梯(ti)度(du)(du)(du) PCR 反(fan)應優化退(tui)火溫(wen)度(du)(du)(du)。

5. 樣品處理不當。

6. Mg2+ 濃度(du)偏高，因適當調整 Mg2+ 使用濃度(du)。

7. 若為 PCR 試劑盒(he)，也可能時試劑盒(he)本身質量有問題。

8. 復制提前(qian)終止(zhi)。使用(yong)非熱啟(qi)動的(de)聚合酶(mei)時常有發生。冰上準備反應體系或采(cai)用(yong)熱啟(qi)動聚合酶(mei)。

9. 反(fan)應(ying)(ying)緩沖液未(wei)完全融化或未(wei)充(chong)分混(hun)勻。確保反(fan)應(ying)(ying)緩沖液融化完全并徹底混(hun)勻。

10. 引物(wu)特(te)異性(xing)差。利用(yong) BLAST 檢查引物(wu)特(te)異性(xing)或重新設計引物(wu)。

11. 引物量(liang)過多。減少(shao)反應體系中引物的用量(liang)。

12. 模板量(liang)過多(duo)。質粒 DNA 的用量(liang)應 < 50 ng，而基因組 DNA 則應 < 200 ng。

13. 外源(yuan) DNA 污染。確保(bao)操作的潔凈。

陰性對照出現條帶

試(shi)劑，槍(qiang)頭，工(gong)作(zuo)臺(tai)污染(ran)。使用全新的試(shi)劑和(he)槍(qiang)頭，對工(gong)作(zuo)臺(tai)進行清潔。

條帶大小與理論不符

1. 污染(ran)。使用全新(xin)的試劑和槍頭，對工作臺進行清潔。

2. 模(mo)板(ban)或引物使用錯誤。更換引物和模(mo)板(ban)。

3. 基因(yin)亞型。對研(yan)究(jiu)的(de)基因(yin)進行序列分析和(he) BLAST 研(yan)究(jiu)。